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Wie lassen sich häufige Probleme im Zusammenhang mit dem His-tag-System umgehen?

Der His-tag (6xHis-tag, His6-tag oder Polyhistin-tag) ist ein beliebter Affinitäts-Tag für die Proteinreinigung, da seine geringe Größe eine geringe Auswirkung auf die Proteinstruktur gewährleistet. Während das His-tag-System wegen seiner hohen Ausbeute und niedrigen Kosten beliebt ist, wird der Zeit- und Arbeitsaufwand für eine erfolgreiche His-tag-Reinigung oft nicht berücksichtigt.

Die folgenden Probleme sind häufig mit dem His-tag-System verbunden:
  • Geringe Proteinreinheit aufgrund unspezifischer Bindung von Wirtsproteinen (Abbildung 1A)
  • Proben- oder Pufferkomponenten stören die Proteinbindung
  • Proteinausfällung nach der Reinigung aufgrund von inkompatiblen Pufferkomponenten
  • Kulturmedien für Säugetierzellen stören die Proteinbindung oder verursachen Ni2+-Leakage
  • Der für das Zielprotein erforderliche pH-Wert führt zur Elution aus der Ni-NTA-Agarose
  • Eingeschränkte Anwendbarkeit in der Proteinanalyse aufgrund geringer Tag-Liganden-Affinität und -Spezifität

Um diese Probleme zu vermeiden oder zu lösen, ist eine sorgfältige Planung des Verfahrens und eine Optimierung des His-tag-Reinigungsprotokolls erforderlich. Schließlich kann es vorkommen, dass ein His-tag immer noch keine zufriedenstellenden Ergebnisse liefert oder für eine bestimmte Art von Protein überhaupt nicht geeignet ist. In diesem Fall sollte ein anderer Affinitäts-Tag in Betracht gezogen werden.

Das Strep-tag®-System ist die ideale Alternative zum His-tag, da alle üblichen Probleme vermieden werden. Aufgrund der spezifischen Tag-Ligand-Interaktion führt die Proteinisolierung mit diesem System zu hochreinem Protein ohne weitere Optimierungs- oder Verarbeitungsschritte (Abbildung 1B).

His-tag contamination

Abbildung 1: GFP, das entweder an einen 6xHis-tag (A) oder an einen Twin-Strep-tag® (B) fusioniert ist, wurde aus E. coli-Lysaten isoliert, wobei die Standardprotokolle der Hersteller der verwendeten Resins (Ni-NTA von Thermo Fisher Scientific für His-tag und Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity von IBA Lifesciences für Twin-Strep-tag®) verwendet wurden.

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Was sind die Ursachen für Verunreinigungen bei der His-tag-Reinigung und wie lassen sich Verunreinigungen beseitigen?

His-tag wird durch Übergangsmetallionen gebunden, von denen Nickel (Ni2+) am häufigsten verwendet wird. Nitrilotriessigsäure (NTA) oder Iminodiessigsäure (IDA) dienen normalerweise als Trägermatrix für Ni2+. Beim His-tag-Reinigungssystem, einer Art immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC), können sowohl die Art des Tags als auch die entsprechenden Tag-bindenden Metallionen (z. B. Ni2+, Kobalt (Co2+) oder Kupfer (Cu2+)) Verunreinigungen verursachen:

Workflow purification to downstream applications with his-tag vs strep-tag

Abbildung 2: Da His-haltige Proteine unspezifisch an Ni-NTA-Resins binden, ist eine Titration von Wasch- und Elutionspuffern erforderlich. Darüber hinaus können weitere Verarbeitungsschritte wie z. B. Größenausschlusschromatographie oder Filtration erforderlich sein, um die Reinheit für weitere Experimente ausreichend zu erhöhen. Bei diesem Schritt geht Protein verloren, was die Gesamtproteinausbeute verringert. Im Gegensatz dazu binden Strep-tag®II und Twin-Strep-tag® mit hoher Spezifität an ihre Liganden, was zu einem hochreinen Proteinpräparat führt, welches direkt für weitere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden kann.

  • "His" oder "Histidin" ist eine Aminosäure, die in Wirtsproteinen vorkommen kann. Aufeinanderfolgende His-Reste verursachen eine unspezifische Bindung an die chelatierten Metalle auf dem His-tag-Reinigungsresin.
  • Wirtsproteine können eine intrinsische Affinität zu Ni2+ oder Co2+ haben.

Um die Reinheit von His-tag-Proteinen zu erhöhen, bieten mehrere Schritte vor, während und nach dem Reinigungsprozess Optimierungspotenzial.

In einem ersten Schritt kann dem Zelllysepuffer und den Waschpuffern das Elutionsmittel Imidazol in niedriger Konzentration zugesetzt werden. Auf diese Weise kann eine unspezifische Bindung von intrinsischen Proteinen mit His-tag verhindert werden. Die Imidazolkonzentration, die nur die Bindung von His-haltigen Wirtsproteinen hemmt und die Bindung von 6xHis-markierten Zielproteinen noch zulässt, muss jedoch sorgfältig titriert werden. Ebenso kann eine schrittweise Anpassung der Imidazolkonzentration während der Elution dazu beitragen, His-tag-Verunreinigungen zu eliminieren. Wenn diese Ansätze nicht erfolgreich sind, kann eine Erhöhung der Anzahl der His-Reste von z. B. 6 auf 10 eine stärkere Bindung des Zielproteins bewirken und höhere Imidazolkonzentrationen beim Waschen ermöglichen, um Verunreinigungen zu entfernen. Dies bedeutet jedoch, dass man wieder bei Null anfangen muss, da die Proteinexpression angepasst werden muss.

Ist die Reinheit des His-tag-Zielproteins nach Änderung des Reinigungsverfahrens nicht zufriedenstellend, können zusätzliche Verarbeitungsschritte in Betracht gezogen werden. Dazu gehören Größenausschluss- oder Ionenaustauschchromatographie, Filtration oder Dialyse. Der Nachteil dabei ist, dass alle zusätzlichen Schritte Proteinverluste und zusätzliche Kosten verursachen können (Abbildung 2).

Im Gegensatz dazu wurden die beiden Tags, die bei der Strep-tag®-basierten Proteinreinigung verwendet werden (Strep-tag®II und Twin-Strep-tag®), speziell für den Einsatz in dieser Technologie entwickelt. Im Gegensatz zu His-Resten ist es daher unwahrscheinlich, dass sie auf natürliche Weise in Proteinen vorkommen und an das Reinigungsresin binden (Abbildung 3). Falls bei der Strep-tag®-Reinigung Verunreinigungen auftreten, handelt es sich in der Regel um biotinylierte Proteine, die leicht und spezifisch mit Avidin blockiert werden. Ansonsten können gebrauchsfertige Wasch- und Elutionsverfahren wie empfohlen angewendet werden.

Ni-NTA unspecific binding

Abbildung 3: E. coli-Lysat wurde zu Ni-NTA (A) oder zu Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity (HC) Resin (B) gegeben. Verunreinigungen wurden nur bei Ni-NTA-Resin aufgrund unspezifischer Bindung von Proteinen mit His-Resten beobachtet.

Welche Reagenzien sind mit dem His-tag-System kompatibel?

Die Entscheidung für oder gegen ein bestimmten Protein-Tag hängt stark von den Eigenschaften des Zielproteins ab. Da pH-Werte von 4,5 bis 6 und Chelatbildner wie EDTA zu einer Elution von His-getaggten Proteinen führen, ist dieses System z. B. für pH-empfindliche Proteine nicht geeignet. Die Verwendung von Chelatbildnern bedeutet auch, dass die Übergangsmetallionen von der Matrix abgelöst werden und nach der Reinigung wieder aufgeladen werden müssen. Außerdem werden Reagenzien wie DTT (Reduktionsmittel), Tris oder MOPS für das His-tag-System nicht empfohlen, was die breite Anwendbarkeit für verschiedene Proteine weiter einschränkt. Neben der unerwünschten Elution von Proteinen kann die Verwendung eines inkompatiblen Reagenzes zur Bildung von Proteinpräzipitaten führen. Im Gegensatz dazu sind Strep-Tactin®XT-Resins mit verschiedenen Reagenzien kompatibel, was es zu einem sehr flexiblen System für verschiedene Proteinklassen macht (siehe Tabelle 1 für eine detaillierte Übersicht über kompatible Reagenzien). So eignet es sich z. B. für Membranproteine, Antikörper und metallionenhaltige Proteine (z. B. Metalloproteasen).

Reagenzien

His-tag-System

Strep-tag®-Technologie

Reduktionsmittel 
DTT
Nicht empfohlen
50 mM
β-Mercaptoethanol
bis zu 20 mM
50 mM
TCEP
Nicht empfohlen
10 mM
Detergenzien
Triton X-100
2%
2%
Tween 20
2%
2%
Chelatbildner
EDTA
Nicht empfohlen
100 mM
EGTA
Nicht empfohlen
100 mM
Metallion/Ligand
CaCl2
5 mM, maximal
1.5 M
Puffer-Komponenten
NaCl
Bis zu 2 M, mindestens 300 mM sollten verwendet werden
5 M
Tris
Nicht empfohlen
Möglich
HEPES
Nicht empfohlen
50 mM
MOPS
Nicht empfohlen

20 mM


Tabelle 1: Kompatible Reagenzien und repräsentative Werte für die His- oder Strep-tag®-basierte Proteinreinigung.

Welcher Expressionswirt ist mit dem His-tag-System kompatibel?

E. coli wird am häufigsten als Expressionswirt für His-getaggte Proteine verwendet. Die Menge der Verunreinigungen, die bei der Reinigung von His-tag-Proteinen aus E. coli-Kulturen auftreten, hängt stark von Faktoren wie der Medienzusammensetzung und anderen Kulturbedingungen, dem genetischen Hintergrund des E. coli-Stamms und dem exprimierten rekombinanten Protein ab. Folglich muss die Optimierung des Protokolls zur Verringerung von Verunreinigungen für jedes rekombinante Protein einzeln durchgeführt werden.

Da E. coli nicht immer für die Proteinexpression geeignet ist, insbesondere für komplexere Proteine, die posttranslationale Modifikationen erfordern, sind alternative Expressionssysteme notwendig. Hefe- und Insektenzellmedien haben jedoch in der Regel einen sauren pH-Wert, der die Bindung von His-getaggten Proteinen an das IMAC-Resin beeinträchtigt. Außerdem enthalten Medien für die Kultivierung von Hefe- oder Säugetierzellen häufig Aminosäuren wie Histidin, Glutamin oder Arginin, die mit dem His-tag um Bindungsstellen konkurrieren.

His-tag
Strep-tag®
E. coli
Wirtsproteine mit konsekutiven His-Resten verursachen Kontaminationen
Keine Einschränkungen
Säugetiere
Medien enthalten Aminosäuren, die mit dem His-tag konkurrieren
Zusätze bewirken ein Stripping von Nickel-Ionen
Keine Einschränkungen
Hefe
Medien mit saurem pH-Wert führen zur Elution von Proteinen
Keine Einschränkungen
Insekt
Medien mit saurem pH-Wert führen zur Elution von Proteinen
Medien enthalten Aminosäuren, die mit dem His-tag konkurrieren
Keine Beschränkungen


Das folgende Whitepaper zeigt die Vorteile der Strep-tag®-Technologie im Vergleich zum His-tag-System in zwei hochdichten Säugetier-Expressionssystemen, Expi293TM und ExpiCHOTM.

Ein weiteres Problem bei der Isolierung von polyhistidin-getaggten Proteinen aus bestimmten Arten von Zellkulturmedien ist das Strippen von Nickelionen aus dem Resin. So ist beispielsweise die Reinigung von His-getaggten Proteinen aus Expi-Überständen mit Ni-NTA-Resins problematisch und wurde mit einem Verlust des Zielproteins im Reinigungsprozess in Verbindung gebracht.

Diese Application Note zeigt, dass ein Standard-Ni-NTA-Resin keine zuverlässigen und vorhersagbaren Reinigungsergebnisse liefert, wenn es für die Proteinreinigung aus Expi-Überständen verwendet wird. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Standard-Ni-NTA-Resins eine signifikante Verringerung der Bindekapazität und der Wiederfindung aufgrund von Nickel-Leakage durch Medienzusätze aufweisen.

Welche Anwendungen sind mit dem His-tag möglich?

Eine Voraussetzung für flexible Anwendungsmöglichkeiten ist die Spezifität und Affinität einer Tag-Ligand-Interaktion. Das His-tag-System verfügt nur über eine Affinität im µM-nM-Bereich. Diese Affinität führt zu einer schnellen Dissoziation und einer schlechten Immobilisierung. Darüber hinaus haben His-tag-Antikörper nur eine geringe Spezifität und können auch unspezifische Proteine mit tandemartig angeordneten His-Resten erkennen. Eine Vielzahl von analytischen Anwendungen, für die eine hohe Affinität und/oder hochspezifische Antikörper erforderlich sind - wie SPR (Oberflächenplasmonenresonanz), BLI (Bio-Layer-Interferometrie) - können nur unzureichend angegangen werden. Insbesondere für kinetische Messungen von hochaffinen Wechselwirkungen ist die nanomolare Affinität von His6-tag zu NTA nicht immer ausreichend. Um dieses Problem zu umgehen, kann ein zweiter Affinitäts-Tag an das Zielprotein fusioniert werden. Dies beeinträchtigt zum einen potenziell die Funktionalität des Proteins und verursacht zum anderen zusätzliche Kosten. Die Strep-tag®-Technologie bietet dagegen eine Affinität im µM-pM-Bereich. Je nach Anwendung kann die passende Affinität gewählt werden. Darüber hinaus ist bereits eine Vielzahl von Produkten für die Strep-tag®-Technologie verfügbar, die einen direkten Übergang von der Proteinreinigung zur analytischen Anwendung ermöglicht.