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Protein-Affinitätschromatographie

Reinigung von Proteinen

Die Isolierung eines Zielproteins aus einem komplexen Gemisch ist eine Voraussetzung für die Funktionsanalyse eines Proteins ohne Störung durch andere Moleküle, weshalb die Proteinreinigung eine der wichtigsten Anwendungen in der Biotechnologie ist. Ein Zielprotein kann am effizientesten durch seine Affinität für ein anderes Molekül isoliert werden, da die Affinität eine einzigartige Eigenschaft ist. Es ist auch möglich, andere Eigenschaften wie Molekülmasse, Ladung oder Hydrophobizität zu verwenden. Jedoch können diese Eigenschaften zwischen verschiedenen Proteinen sehr ähnlich sein.

Um ein Protein mit Hilfe seiner Affinität zu einem anderen Molekül zu reinigen, wird der Interaktionspartner (Ligand), z. B. ein Protein, ein kleines Molekül oder ein Metall, an der stationären Phase der Chromatographiematrix immobilisiert. Die stationäre Phase besteht meist aus Agarose oder synthetischen Polymeren und ist in Form von Beads in eine Säule gepackt. Die Beads sind von einer Flüssigkeit, der so genannten mobilen Phase, umgeben. Wenn die zielproteinhaltige Probe aufgetragen wird, gelangt sie in die mobile Phase und läuft durch die Beads der stationären Phase. Währenddessen kann das Zielprotein an den Liganden binden. Andere Moleküle verbleiben in der mobilen Phase und können durch Waschen entfernt werden. Durch eine Änderungen der Pufferbedingungen kann die Elution des Zielproteins eingeleitet werden. Solche Änderungen können beispielsweise die Verschiebung des pH-Werts sein oder die Zugabe eines Kompetitors, der das Zielprotein vom Liganden verdrängt. Der Ligand wird durch die Änderung der Pufferbedingungen nicht abgelöst und bleibt an der stationären Phase immobilisiert.

Eine solche direkte Affinitätsreinigungsstrategie wird am häufigsten für Antikörper verwendet, die auf Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen basieren. Ein Beispiel ist Protein A (Ligand), das zur Reinigung von Immunglobulin-G-Antikörpern (Zielprotein) verwendet werden kann. Aber wie kann ein Protein gereinigt werden, wenn der Interaktionspartner noch nicht bekannt ist? In diesem Fall kann die Affinität einer bekannten Interaktion für die indirekte Immobilisierung  des Zielproteins genutzt werden. Das Zielprotein wird mit einem Peptid  des einen Interaktionspartners markiert, das an den anderen auf der stationären Phase immobilisierten Interaktionspartner (Ligand) binden kann. Das kurze Peptid des bekannten Interaktionspartners wird als Affinitäts-Tag bezeichnet und kann z. B. der His-tag, GST-tag, Strep-tag®II oder Twin-Strep-tag® sein. Sie können an Liganden wie Metallionen, Glutathion, Strep-Tactin® bzw. Strep-Tactin®XT binden.

Affinity-based protein purification steps

Prinzip der affinitätsbasierten Proteinreinigung

Co-IP using an antibody versus pull-down assay using Strep-Tactin®XT

Vergleich von direkten und indirekten Affinitätsreinigungsstrategien

Aufgrund der hochspezifischen Selektion und der daraus resultierenden Reinheit der Zielproteine haben sich affinitätsbasierte Systeme zu einer der wichtigsten Reinigungsmethoden entwickelt. Einige der weit verbreiteten Affinitäts-Tags, wie z. B. der His-tag, weisen jedoch mehrere Nachteile und Einschränkungen auf, da sie die Protein-Konformation verändern können oder scharfe Elutions- und Waschbedingungen erfordern, die die Ausbeute an funktionalen Zielprotein beeinträchtigen. Darüber hinaus sind viele Tags mit unterschiedlichen Pufferbedingungen nicht kompatibel und müssen entfernt werden, um die nachfolgenden Analysen nicht zu beeinträchtigen.

Die weit verbreitete Strep-tag®-Technologie, die aus den beiden Streptavidin-Varianten Strep-Tactin® und Strep-Tactin®XT sowie den beiden Affinitäts-Tags Strep-tag®II und Twin-Strep-tag® besteht, ist in der Verwendung von Puffern nicht eingeschränkt und führt dank ihrer hohen Spezifität zur Gewinnung hochreiner Proteine.

Daher bietet IBA verschiedene Resins an, die entweder mit Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT gekoppelt sind und für die Reinigung von sowohl  Strep-tagII- als auch Twin-Strep-tag-Fusionsproteinen gleichermaßen geeignet sind. Der Reinigungszyklus variiert zwischen den beiden Streptavidin-Varianten, aber alle Resins dienen dem gleichen Ziel: einfache, schnelle und variable Proteinreinigung für hochreine Proteine.

In den folgenden Applications Notes wird das Strep-Tactin- und Strep-TactinXT-Reinigungssystems am Beispiel der Reinigung von Latex Clearing Protein und weiteren Proteine(1, 2) verglichen.

Die besonderen Unterschiede zwischen dem His-tag System und der Strep-tag® Technologie, werden in einem umfassenden Vergleich dargestellt. Der Vergleich fasst zusammen, welche Unterschiede es gibt und empfiehlt eines der Systeme in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Zielproteins, des Expressionswirts und der Reinigungsbedingungen.

Die Unterschiede zwischen den Systemen bei der Proteinreinigung aus Expi-Überständen werden in dieser Application Note aufgezeigt.

Die einzigartige Strep-tag®-Technologie von IBA ist ein häufig verwendetes Werkzeug für die Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine und basiert auf einer der stärksten nicht-kovalenten Interaktion in der Natur, nämlich der Interatkion von Biotin mit Streptavidin. Das System umfasst zwei Affinitäts-Tags: Strep-tag®II und Twin-Strep-tag® (die Tandemversion des Strep-tag®II). Diese Peptidsequenzen weisen eine intrinsische Affinität zu zwei speziell entwickelten Streptavidin-Varianten auf - Strep-Tactin® und Strep-Tactin®XT.
Die Strep-tag-Technologie steht für höchste Proteinreinheiten unter physiologischen Bedingungen und kann neben der Reinigung in einer Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen eingesetzt werden, zum Beispiel im Bereich der  der Immobilisierung von Proteinen für die Entwicklung von Assays oder für Proteininteraktionsstudien.

Biotin-Blockierung

Blockierung von freiem Biotin in Zellkulturüberständen und Lysaten

Zellkulturüberstände enthalten oft hohe Mengen an freiem Biotin. Diese sind bei der Arbeit mit Strep-TactinXT-Resins unproblematisch, da Biotin weder irreversibel an diesen Liganden bindet noch die Bindungskapazität reduziert. Dies ist jedoch bei der Anwendung von  Strep-Tactin-gekoppelten Resins der Fall. Um die Beeinträchtigung von Strep-Tactin-Resins zu verhindern, kann BioLock, das Avidin enthält, zur Maskierung von freiem Biotin eingesetzt werden. Avidin ist ein Homolog von Streptavidin und findet sich im Eiweiß von Vögeln, Reptilien und Amphibien. Es besteht aus vier Untereinheiten, von denen jede ein Molekül Biotin binden kann. Im Gegensatz zu den Streptavidin-Varianten Strep-Tactin® und Strep-Tactin®XT ist es nicht in der Lage, Strep-tagII- oder Twin-Strep-tag-Fusionsproteine zu binden. Daher kann Avidin verwendet werden, um freies Biotin in Zelllysaten oder Zellkulturüberständen selektiv zu maskieren, während der Strep-tag®II oder Twin-Strep-tag® am Zielprotein zugänglich bleibt. Eine Übersicht über biotinhaltige Medien und zellinterne Biotinpools finden Sie in der Anleitung zur Biotinblockierung. Die Blockierung von Biotin durch BioLock ist einfach und schnell. Es muss nur eine kleine Menge zugegeben werden, und nach einer kurzen Inkubation ist die Probe für die Proteinreinigung bereit.

Blockierung von biotinylierten Proteinen

Neben freiem Biotin enthalten Zelllysate auch geringe Mengen an biotinylierten Proteinen. Normalerweise beeinflussen diese Proteine die Reinigungsergebnisse mit Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT nicht, da sie nur in geringen Mengen vorhanden sind. Bei analytischen Anwendungen mit hoher Empfindlichkeit sollten Verunreinigungen jedoch vermieden werden. Eine Möglichkeit ist die Behandlung der Probe mit BioLock vor der Proteinreinigung. Andernfalls, wenn das Zielprotein bereits gereinigt ist und mittels Western Blot mit Strep-Tactin- oder Strep-TactinXT-Konjugaten nachgewiesen werden soll, ist die Anwendung von Avidin möglich. Kurz vor der Detektion wird die Membran einfach für einige Minuten mit in PBS gelöstem Avidin inkubiert. Erfolgt der Nachweis jedoch mit Hilfe eines Antikröpers, zum Beispiel StrepMAB-Classic , ist eine Maskierung der biotinylierten Proteine nicht notwendig. Im Gegensatz zu Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT bindet der Antikörper nicht an Biotin oder biotinylierte Proteine und führen daher nicht zu unspezifischen Signalen.

Binding patterns of Strep-tag®II, Twin-Strep-tag® and biotin

Bindungsmuster von Strep-tag®II, Twin-Strep-tag® und Biotin