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MEXi Mammalia Expressionssystem

Säugetierzellen werden häufig für die Expression rekombinanter Proteine verwendet, wenn eine komplexe Glykolyse und eine genaue Proteinfaltung wichtig sind. Das MEXi-System bietet ein erschwingliches Mammalia Expressionssystem mit allen wesentlichen Komponenten. MEXi-293E-Zellen sind humane embryonale Nierenzellen (HEK-Zellen), die von der 293-Zelllinie abgeleitet und für das Suspensionswachstum in einem kostengünstigen Zellkulturmedium mit niedrigem Biotingehalt angepasst sind. Dies ermöglicht eine hocheffiziente und spezifische Aufreinigung von rekombinanten Proteinen über Strep-Tactin®XT unter physiologischen Bedingungen.

Das MEXi-System nutzt die transiente Expression anstelle der stabilen Transformation, um eine schnelle und kurzfristige Produktion des rekombinanten Proteins über mehrere Tage nach der DNA-Transfektion zu ermöglichen. Dies geschieht durch episomale Replikation und Expression des eingebrachten Gens ohne vorherige Integration, indem das EBNA1-Protein in Kombination mit oriP-tragenden Plasmiden verwendet wird. Darüber hinaus nutzt das System eine Transfektion auf Polyethylenimin-Basis, eine kostengünstige und schnelle Methode, die auch für schwer zu transfizierende Zelllinien geeignet ist und gleichzeitig zytotoxische Effekte wie bei lipidbasierten Techniken oder eine komplizierte virale Hülle vermeidet. IBA Lifesciences bietet Produkte an, die über die Proteinexpression und -reinigung hinausgehen, wie z.B. Reagenzien für den spezifischen Nachweis mit Hilfe der Strep-tag®-Technologie. So kann die gesamte Forschungsaufgabe mit synchronisierten Protokollen innerhalb einer Technologieplattform einfach durchgeführt werden.

Expressionswirte

Besonderes Augenmerk sollte auch auf die Wahl des geeigneten Expressionswirts für das gewünschte Protein gelegt werden, um sicherzustellen, dass ein biologisch funktionsfähiges Zielprotein gebildet wird. Während E. coli aufgrund der einfachen Handhabung und Kompatibilität mit einer großen Anzahl von Targets die bekanntesten Wirtszellen sind, werden eukaryotische Zelllinien wie Hefen, Insektenzellen oder Säugetierzellen benötigt, um komplexe Proteine mit korrekter Faltung und posttranslationalen Modifikationen zu erhalten. Säugetierzellen sind zum beliebtesten Wirt für die rekombinante Proteinexpression geworden, insbesondere für Antikörper, therapeutische Proteine oder biopharmazeutische Produkte. HEK-Zellen (Human Embryonic Kidney 293) werden häufig in der Arzneimittelentwicklung und in Laboratorien verwendet, da sie ein einfach in Kultur zu halten sind, eine hohe Transfektionseffizienz haben und sich für eine Vielzahl von Transfektionsmethoden eignen.

IBAs MEXi-293E Zellen sind von der 293er Zelllinie abgeleitete humane embryonale Nierenzellen (HEK), die für die Expression rekombinanter Proteine in Säugetierzellen optimiert und speziell für ein effizientes Wachstum in den entsprechenden Zellkulturmedien MEXi TM (Transfektionsmedium) und MEXi CM (Kulturmedium) angepasst sind.

Um einen einfachen Zugang zu den verschiedenen Expressionswirten zu ermöglichen, bieten wir eine Vielzahl von Plasmiden an, die auf die verschiedenen Wirte abzielen, darunter E. coli und Säugetierzellen, aber auch Hefe- und Insektenzellen (Baculovirus-Vektoren).

Acceptor vectors

Transfektion/ Transformation

Im nächsten Schritt muss der zuvor erstellte Expressionsvektor, der das betreffende Gen trägt, in den gewählten Expressionswirt übertragen werden, um sich dort zu vermehren und das Zielprotein zu produzieren. Dies kann durch verschiedene Methoden geschehen, von denen Transformation und Transfektion die am häufigsten angewandten sind. Bei der Transformation wird der rekombinante Vektor aus einem Reaktionsgemisch oder einer Vektorlösung in einen prokaryontischen Expressionswirt, wie z. B. E. coli-Zellen, eingebracht. Es handelt sich dabei um eine natürlich vorkommende direkte Aufnahme von DNA-Fragmenten, die durch verschiedene physikalisch-chemische Stimuli (Hitzeschock, Kalziumbehandlung oder Elektroporation) in der Laborumgebung ausgelöst wird. Sobald das Gen auf dem Plasmid in der Zelle angekommen ist, kann es durch eine geeignete Induktionsmethode einfach exprimiert werden. Im Gegensatz dazu ist die Transfektion eine komplexere Technik, um das rekombinante DNA-Konstrukt in eukaryontische Zellen, genauer gesagt in deren Zellkern, einzubringen. Bei dieser Methode müssen transiente Poren in der Zellmembran geöffnet werden (virale Verpackung mit Kalziumphosphat-Behandlung, Elektroporation, kationische Polyamide oder Lipid-Shuttling), um die Aufnahme des genetischen Konstrukts in das Zytosol und anschließend den Transport in den Zellkern durch die vom Vektor bereitgestellten Signalsequenzen zu induzieren. Durch einen wiederholten Prozess der sorgfältigen Selektion und Amplifikation werden stabile Klone hergestellt, die die fremde Information in ihr Genom integriert haben.

Trotz des Vorteils, dass alle Nachkommen dieser Zellen das betreffende Gen enthalten und an der Produktion des Zielmoleküls beteiligt sind, ist die stabile Transfektion ein mühsamer Prozess, der vor allem für die Produktion rekombinanter Proteine in großem Maßstab empfohlen wird. Um dagegen schnell Forschungsmengen des Targets zu erhalten, ist die transiente Expression die Methode der Wahl. Diese Technik führt zu einer schnellen und kurzfristigen Produktion des rekombinanten Proteins über mehrere Tage nach der DNA-Transfektion. Das MEXi-Expressionssystem für Säugetiere von IBA setzt diesen transienten Ansatz um und ermöglicht die einfache und effiziente episomale Replikation und Expression des entsprechenden Gens ohne vorherige Integration, indem es das EBNA1-Protein in Kombination mit oriP-tragenden Plasmiden verwendet. Darüber hinaus nutzt das System eine auf Polyethylenimin basierende Transfektion, die eine erschwingliche und schnelle Methode darstellt, die selbst für schwer zu transfizierende Zelllinien geeignet ist, während gleichzeitig zytotoxische Effekte wie bei lipidbasierten Techniken oder eine komplizierte virale Verpackung vermieden werden.

MEXi mammalian expression workflow

MEXi Arbeitsablauf und Komponenten

Das MEXi-System wurde entwickelt, um ein erschwingliches System für die Expression von Säugetierproteinen anzubieten, das alle wesentlichen Komponenten enthält: 
  • MEXi-293E-Zelllinie
  • eine Vielzahl von pDSG-Expressionsvektoren
  • MEXi-CM-Kulturmedium
  • MEXi-TM-Transfektionsmedium 

Weitere Vorteile: 
  • Transiente Expression für zeit- und kosteneffiziente Proteinproduktion
  • Mehrere Expressionsvektoren mit unterschiedlichen Eigenschaften
  • Optimiert für Twin-Strep-tag®:Strep-Tactin®XT System für hochreine Proteine
  • IP-freies System

Anwendungsbeispiele 

Das MEXi-System, bestehend aus MEXi 293E-Zellen, pDSG-IBA-Expressionsvektoren, MEXi-TM-Transfektionsmedium und MEXi-CM-Nährmedium, wurde zur Expression verschiedener Proteine eingesetzt. Die anschließende Aufreinigung erfolgte entweder mit Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT Resins. Ausbeute und Reinheit wurden mittels SDS-PAGE analysiert. 

Metalloprotein

Typ: Metalloprotein, Hydrolase 

Ausbeute: 143 mg/l. 

Die sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) wurde mit einem C-terminalen Twin-Strep-Tag® und dem BM40-Sekretionssignal durch Klonierung in pDSG-IBA102 fusioniert. MEXi 293E Zellen (1,5 x 106 Zellen/ml) wurden in MEXi-TM Transfektionsmedium (17 ml) mit Polyethylenimin (PEI, 25 kDa) transfiziert. Anschließend wurde die Zellkultur 4 Stunden lang inkubiert (37 °C, 5 % CO2, 125 U/min) und dann mit MEXi-CM-Nährmedium verdünnt, um eine Zelldichte von 0,75 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Die Zellen wurden 7 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2 und 125 U/min gehalten, um eine hohe Proteinausbeute zu erzielen. Für die Aufreinigung wurden die Zellen pelletiert und der Überstand, der das SEAP-Protein enthielt, abgetrennt. Freies Biotin wurde mit Avidin-haltigem BioLock blockiert. Das SEAP-Protein wurde schließlich mit einer Gravity Flow-Strep-Tactin®-Säule gereinigt.

Antikörper

Typ: Antikörper

Ausbeute: 96 mg/l (dargestellt durch schwere (HC) und leichte Kette (LC)) 

Der monoklonale Rattenantikörper (mAb) wurde in den pDSG-IBA102-Vektor kloniert, um die schwere Kette (HC) C-terminal mit dem Twin-Strep-tag® und dem BM40-Sekretionssignal zu fusionieren. Die Transfektion von MEXi 293E Zellen wurde in MEXi-TM Transfektionsmedium (250 ml) mit Polyethylenimin (PEI, 25 kDa) durchgeführt. Die Zellen wurden 4 Stunden lang inkubiert (37 °C, 5 % CO2, 125 U/min), und als eine Zelldichte von 3 x 106 Zellen/ml erreicht war, wurden 250 ml MEXi-CM-Nährmedium hinzugefügt. Danach wurde die Kultur auf 32 °C gebracht und bis zum 10. Tag inkubiert. Um die Zellen vom Überstand zu trennen, wurde die Zellsuspension gemäß des MEXi-Protokolls zentrifugiert. Freies Biotin wurde mit avidinhaltigem BioLock blockiert. Der Überstand wurde für die Proteinreinigung über eine Gravity Flow-Strep-Tactin®-Säule verwendet. Der WET FRED wurde verwendet, um die Beladung des großen Überstandsvolumens auf die Säule zu erleichtern.

Kundenprotein

Ausbeute: 318 mg/l  

Die kodierende Sequenz des Kundenproteins wurde in pDSG-IBA102 kloniert, was zu einem rekombinanten Protein mit C-terminalem Twin-Strep-Tag® und BM40-Sekretionssignal führte. 1050 ml MEXi-TM wurden mit MEXi 293E-Zellen beimpft. Anschließend wurde Plasmid-DNA zugegeben, gefolgt von der Zugabe von linearem 25 kDa PEI. Die Zellen wurden 4 Stunden lang in MEXi-TM-Medium bei 37 °C, 5 % CO2 und 125 U/min in einem Orbitalschüttelinkubator inkubiert. Die Zellen wurden durch Zugabe eines Volumens MEXi-CM auf 7,5 x 105 Zellen/ml verdünnt und 7 Tage lang bei 37 °C gelagert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und der Überstand, der das Kundenprotein enthielt, wurde abgenommen. Das Kundenprotein wurde schließlich mit Strep-Tactin®XT aufgereinigt. Die Abbildung zeigt die Elutionsfraktionen (E1-E3). Für die SDS-PAGE-Analyse wurde für E1 und E2 eine Verdünnung von 1:10 hergestellt.